一、細(xì)胞或組織破碎
1. 微生物材料
（1）發(fā)酵3~4天（或?qū)?shù)生長期）的菌體，離心收集菌絲體（動植物材料無需此步處理）。
（2）用經(jīng)DEPC處理的水洗菌絲體2~3次，并盡量除去殘存的水。
（3）加液氮充分研磨，使其成為粉末，以釋放RNA。
（4）研磨后的樣品轉(zhuǎn)移至12 ml 變性液的容器中勻漿。
2. 動植物細(xì)胞培養(yǎng)材料 （適用的樣品量為細(xì)胞：108）
（1）細(xì)胞或組織培養(yǎng)：按常規(guī)方法進(jìn)行。
（2）深層懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的破碎。
①細(xì)胞收集：含一定濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液置于無菌離心管中，4℃，3 000 g 離心5分鐘。
②細(xì)胞洗滌：上步沉淀用25 ml 滅菌后冰凍的1xPBS緩沖液洗滌，然后4℃，3 000 g 離心5分鐘。
③細(xì)胞破碎：在沉淀細(xì)胞中加入15 ml 預(yù)冷的變性液，用無菌處理過的勻漿器勻漿。
3. 表面培養(yǎng)細(xì)胞的破碎
（1）確定培養(yǎng)瓶數(shù)量，使選定的各培養(yǎng)瓶細(xì)胞累加后總量達(dá)108。
（2）細(xì)胞收集：將培養(yǎng)液倒掉，用預(yù)冷的無菌PBS緩沖液洗滌一次，在培養(yǎng)瓶中加入8 ml 預(yù)冷變性液。
（3）轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞溶解，此時可見粘度加大。
（4）用無菌吸管將第一個培養(yǎng)瓶中的液體吸入第二個培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)，溶解細(xì)胞，再吸入第三個培養(yǎng)瓶，以此類推。
（5）直到將所選定的培養(yǎng)瓶全部洗滌一次，然后從第一個培養(yǎng)瓶開始再加入4毫升上述變性液，將所有培養(yǎng)瓶洗一次。
（6）將上述12 ml 含細(xì)胞的變性液轉(zhuǎn)移至一50 ml 無菌離心管中，勻漿破碎細(xì)胞。
4. 植物組織破碎 （適用的樣品量為0.05 g 組織）
（1）將600 ul 變性液置于1.5 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）將0.05 g 新鮮組織用液氮冰凍。
（3）在液氮下，研磨組織塊。
（4）待液氮揮發(fā)后，將上述分散的組織轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。
5. 動物組織破碎 （適用的樣品量為1 g 組織）
（1）將12 ml 變性液置于50 ml 離心管中，將此離心管放于冰浴中5分鐘。
（2）在上述管中加入1 g 新鮮或冰凍動物組織，勻漿粉碎。
二、RNA 的抽提
1. 在經(jīng)變性液勻漿的細(xì)胞或組織600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
2. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
3. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
4. 上層水相吸至無菌離心管中加等體積的異丙醇，-70℃，30分鐘沉淀RNA。
5. 離心4℃，10 000 g，20分鐘。
6. 沉淀RNA ，冷凍干燥15分鐘 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 變性液中，可振蕩（有時為了幫助溶解，可在65℃加熱，但時間應(yīng)極短）。
7. 60 ul pH4.0的2 M 乙酸鈉徹底混勻，可用漩渦振蕩器。
8. 600 ul 酚\氯仿\異戊醇（25\24\1），徹底混勻或漩渦振蕩器振蕩10秒。
9. 冰裕中10~15分鐘，離心，4℃，10 000 g，20分鐘。
10. 上層水相吸至無菌離心管中。
11. 等體積異丙醇二次沉淀（-70℃，30分鐘），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷凍干燥。
12. 復(fù)溶于去RNA 酶的水中（對于準(zhǔn)備長期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸鈉至終濃度為0.25 M，再加入2.5體積的乙醇，-70℃保存。）。
