MMP-2&MMP-9明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明介紹

1. 簡(jiǎn)介：

基質(zhì)金屬蛋白酶 (Matrix metalloproteinase ，MMP) 屬于金屬蛋白酶家族，該家族由至少 20 個(gè)成員組成，并且已知參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的代謝。它們以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱(chēng)膠原酶。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。MMP 可通過(guò)酶譜法廣泛檢測(cè)。MMP2 & MMP9  Gelatin-Zymography Kit提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的酶譜電泳系統(tǒng)，用于檢測(cè)血液、體液、分泌物、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)基等樣品中的MMP2,MMP9酶譜及活性。

2. 檢測(cè)原理：

本試劑盒采用凝膠反相酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性及其無(wú)活性前體酶原譜系。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備含有膠原酶底物的SDS-PAGE凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳時(shí)SDS與樣本中的MMP可逆性結(jié)合，導(dǎo)致MMP氫鍵和疏水鍵破壞而不能發(fā)揮分解明膠的作用。電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer孵育，MMP恢復(fù)活性，凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行25-50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)（如果樣本MMP含量高，孵育時(shí)間短，不用換液可最多50次），如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可最多檢測(cè)500~750個(gè)樣品。

3. 檢測(cè)目的:

本試劑盒用于檢測(cè)組織、細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 酶譜活性及其前體酶原酶譜。

4.  試劑盒組成與儲(chǔ)存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml, −20 ºC保存；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC保存；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC保存, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?o:p>

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC保存, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋?zhuān)?o:p>

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液,50ml, 4 ºC保存。

5.檢測(cè)步驟：

5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS-PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2 待測(cè)樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液�？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。

陽(yáng)性對(duì)照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。陽(yáng)性對(duì)照也可使用用戶熟悉易得的組織細(xì)胞樣品來(lái)制備。 

注：因?yàn)槿�血成分�?fù)雜,MMP活性較低，最好是將全血中白蛋白進(jìn)行分離做陽(yáng)性對(duì)照

5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20mAl。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。

5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)�？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠36小時(shí)，中間18小時(shí)換液一次。如MMP活性低，Buffer A 孵育時(shí)間可延長(zhǎng)至48小時(shí)，中間24小時(shí)換液一次。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時(shí)即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。

5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。    

MMP透明條帶的大小、位置和酶譜的圖例。注意因?yàn)闃悠肺催�原和加熱變性，條帶位置并不對(duì)應(yīng)推算的蛋白分子量。下圖1，正常血漿樣品陽(yáng)性對(duì)照可能出現(xiàn)的反相顯示的透明條帶位置：66kDa(MMP-2)，72kDa(proMMP-2)，87kDa(MMP-9)，92kDa(proMMP-9)，注意血漿中只有很少量的激活狀態(tài)的66kDa的MMP2，增加上樣量在ProMMP2下面隱約可見(jiàn)(最右側(cè)泳道)。

如下圖2，不同于正常血漿MMP酶譜，每種組織樣品(如牙周膜韌帶組織)都具有自己特定的MMP活性酶譜，部分proMMP9(92kDa)可能會(huì)結(jié)合一個(gè)25kDa微球蛋白形成MMP9復(fù)合物，條帶位置約125-130kDa，其二聚體條帶大約在215-225kDa位置(圖中并未顯現(xiàn))，多聚體條帶位置240kDa，嚴(yán)格說(shuō)他們都是MMP9復(fù)合體，但也有人稱(chēng)其為proMMP-9。注意在這種組織中activeMMP9活性低，但activeMMP2活性高，與血漿MMP活性酶譜形成了鮮明的對(duì)比

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中最常見(jiàn)的格式。

6.說(shuō)明：

1. 10 mM EDTA能夠完全抑制MMP活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為永久記錄保留。

3. 本試劑盒僅供科研實(shí)驗(yàn)使用，不得用于食用、臨床醫(yī)療等其它用途。

4.實(shí)驗(yàn)操作中，請(qǐng)穿戴好實(shí)驗(yàn)服、防護(hù)口罩和一次性實(shí)驗(yàn)手套，避免直接接觸。嚴(yán)禁入口。